X-Gal與X-α-gal有什么不同？二者可以互相替換嗎？

　　X-Gal是E.coliβ-半乳糖苷酶（LacZ）的反應底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反應底物。X-α-gal用作酵母雙雜交系統中藍白篩選的篩選標記。二者不可以互相替換。

　　X-α-Gal檢測酵母MEL1基因的激活。MEL1是GAL4酵母雙雜交系統的一個報告基因，編碼分泌型的α-半乳糖苷酶。該酶可水解無色的X-α-Gal底物并最終產生藍色產物。表達α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培養基上顯藍色，即陽性的雙雜交作用。X-α-Gal可在培養基上直接檢測酵母雙雜交相互作用，利用此底物可以省去雙雜交體系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays；

　　X-Gal用于檢測β-半乳糖苷酶（LacZ）的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母細胞后通過加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能進行顯色。因此操作流程相對繁瑣。

　　攜帶MEL1基因的酵母菌株：Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A

　　1、X-α-gal使用方法

　　一、涂布于預制平板：

　　1）溶解24mgX-α-gal于6mLDMF，終濃度為4mg/mL。

　　2）涂布200μL(15cm) 或者100μL（10cm）X-α-gal儲存液于預制平板上；

　　3）置于37℃培養箱至液體被吸收（由于DMF揮發性低，最長可放4小時）；

　　4） 將轉化細菌或酵母涂于平板上，于37℃或30℃培養直至藍色菌落出現。

　　二、直接加入瓊脂中：

　　1）溶解60mgX-α-gal于3mLDMF，終濃度為20mg/mL。

　　2）將已滅菌瓊脂培養基冷卻至50-55℃；

　　3）向上述培養基中加入20mg/mLX-α-Gal，比例為每升培養基中加入1mLX-α-Gal溶液。

　　2、X-gal使用方法（filter-liftassays）

　　試劑準備

•        Z buffer
  

　　16.1g/L   Na2HPO4·7H2O

　　5.50g/L   NaH2PO4·H2O

　　0.75g/L   KCl

　　0.246g/L  MgSO4·7H2O

　　調節pH7.0，高溫高壓滅菌?？墒覝乇４妗！?/p>

　　20mg/mLX-gal儲液（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside），溶于DMF，保存于-20。

• 　　Z緩沖液/X-gal溶液
  

　　100mL     Zbuffer

　　1.67mL   X-gal 儲液

　　0.27mL    β-mercaptoethanol

　　實驗流程

　　1.生長2-4天的新鮮單菌落;用鉛筆在濾紙上畫8×8的方格，每個方格放置一個新鮮培養的單菌落并記錄下編號;

　　2. 配制Zbuffer/X-gal反應液;

　　3. 在干凈平皿中鋪一張濾紙，用Zbuffer/X-gal反應液(2.5-5mL)將濾紙浸濕;

　　4.用鑷子另取一張無菌、干燥的濾紙，鋪在劃線培養的酵母菌表面，用鑷子輕輕滾壓，使菌轉移到濾紙表面(注:在濾紙上做好方位標記，以便識別菌種編號);

　　5.當濾紙全部濕潤，用鑷子將鋪有菌落的濾紙放入液氮中速凍30sec，液氮需沒過菌落;

　　6. 取出濾紙，放置于一干凈平皿中使其室溫解凍;

　　7.用鑷子將解凍的濾紙輕輕疊放在浸有反應液的濾紙上(有菌的表面朝上)，保證兩層濾紙間沒有氣泡;30°C，培養8h，觀察X-gal染色情況。菌落變為藍色的為陽性，超過8h變藍，很有能是假陽性。

　　注意事項：

　　1.x-gal注意遮光保存。

　　2.液氮冰凍菌的時候可以試試反復凍融，這樣會使細胞破碎的更加完全一些，便于染色液的滲透。