X-Gal與X-α-gal有什么不同？二者可以互相替換嗎？
X-Gal是E.coliβ-半乳糖苷酶（LacZ）的反應(yīng)底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反應(yīng)底物。X-α-gal用作酵母雙雜交系統(tǒng)中藍(lán)白篩選的篩選標(biāo)記。二者不可以互相替換。
X-α-Gal檢測(cè)酵母MEL1基因的激活。MEL1是GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)報(bào)告基因，編碼分泌型的α-半乳糖苷酶。該酶可水解無(wú)色的X-α-Gal底物并最終產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。表達(dá)α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培養(yǎng)基上顯藍(lán)色，即陽(yáng)性的雙雜交作用。X-α-Gal可在培養(yǎng)基上直接檢測(cè)酵母雙雜交相互作用，利用此底物可以省去雙雜交體系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays；
X-Gal用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶（LacZ）的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母細(xì)胞后通過(guò)加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能進(jìn)行顯色。因此操作流程相對(duì)繁瑣。
攜帶MEL1基因的酵母菌株：Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A
1、X-α-gal使用方法
一、涂布于預(yù)制平板：
1）溶解24mgX-α-gal于6mLDMF，終濃度為4mg/mL。
2）涂布200μL(15cm) 或者100μL（10cm）X-α-gal儲(chǔ)存液于預(yù)制平板上；
3）置于37℃培養(yǎng)箱至液體被吸收（由于DMF揮發(fā)性低，最長(zhǎng)可放4小時(shí)）；
4） 將轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母涂于平板上，于37℃或30℃培養(yǎng)直至藍(lán)色菌落出現(xiàn)。
二、直接加入瓊脂中：
1）溶解60mgX-α-gal于3mLDMF，終濃度為20mg/mL。
2）將已滅菌瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50-55℃；
3）向上述培養(yǎng)基中加入20mg/mLX-α-Gal，比例為每升培養(yǎng)基中加入1mLX-α-Gal溶液。
2、X-gal使用方法（filter-liftassays）
試劑準(zhǔn)備
Z buffer
16.1g/L Na2HPO4·7H2O
5.50g/L NaH2PO4·H2O
0.75g/L KCl
0.246g/L MgSO4·7H2O
調(diào)節(jié)pH7.0，高溫高壓滅菌。可室溫保存。
20mg/mLX-gal儲(chǔ)液（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside），溶于DMF，保存于-20。
Z緩沖液/X-gal溶液
100mL Zbuffer
1.67mL X-gal 儲(chǔ)液
0.27mL β-mercaptoethanol
實(shí)驗(yàn)流程
1.生長(zhǎng)2-4天的新鮮單菌落;用鉛筆在濾紙上畫(huà)8×8的方格，每個(gè)方格放置一個(gè)新鮮培養(yǎng)的單菌落并記錄下編號(hào);
2. 配制Zbuffer/X-gal反應(yīng)液;
3. 在干凈平皿中鋪一張濾紙，用Zbuffer/X-gal反應(yīng)液(2.5-5mL)將濾紙浸濕;
4.用鑷子另取一張無(wú)菌、干燥的濾紙，鋪在劃線培養(yǎng)的酵母菌表面，用鑷子輕輕滾壓，使菌轉(zhuǎn)移到濾紙表面(注:在濾紙上做好方位標(biāo)記，以便識(shí)別菌種編號(hào));
5.當(dāng)濾紙全部濕潤(rùn)，用鑷子將鋪有菌落的濾紙放入液氮中速凍30sec，液氮需沒(méi)過(guò)菌落;
6. 取出濾紙，放置于一干凈平皿中使其室溫解凍;
7.用鑷子將解凍的濾紙輕輕疊放在浸有反應(yīng)液的濾紙上(有菌的表面朝上)，保證兩層濾紙間沒(méi)有氣泡;30°C，培養(yǎng)8h，觀察X-gal染色情況。菌落變?yōu)樗{(lán)色的為陽(yáng)性，超過(guò)8h變藍(lán)，很有能是假陽(yáng)性。
注意事項(xiàng)：
1.x-gal注意遮光保存。
2.液氮冰凍菌的時(shí)候可以試試反復(fù)凍融，這樣會(huì)使細(xì)胞破碎的更加完全一些，便于染色液的滲透。
