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發布于 2023-09-14
淀粉酶活性的測定
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一、淀粉酶活性的測定實驗原則:※ 淀粉酶(淀粉酶)包括幾個具有不同催化特性的成員。其中,α-淀粉酶隨機作用在淀粉的非還原端上,產生麥芽糖,麥芽三糖,糊精等還原糖,同時降低淀粉漿的粘度。因此,它也被稱為液化酶。每次β-淀粉酶都會從淀粉的非還原端切割出一個麥芽糖分子,也稱為糖化酶。葡萄糖淀粉酶每次都從淀粉的非還原末端切出一個葡萄糖。由淀粉酶產生的這些還原糖可以還原3,5-二硝基水楊酸以產生棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。淀粉酶活性的大小與產生的還原糖的量成正比。可以用麥芽糖繪制標準曲線,并且可以通過比色法確定由淀粉產生的還原糖的量。在一定時間內每單位重量樣品產生的還原糖量表示酶活性。
 ※ 淀粉酶幾乎存在于所有植物中,尤其是發芽后谷物種子的淀粉酶活性最強,主要是α-和β-淀粉酶。 α-淀粉酶不耐酸,在pH 3.6以下會迅速失活; β-淀粉酶不耐熱,在70°C滅活15分鐘。根據它們的特性,當其中一個在測量過程中被停用時,可以測量另一個的生命力。在該實驗中,通過加熱使β-淀粉酶失活來測量α-淀粉酶的活性,然后通過與在非鈍化條件下測得的總活性(α+β)進行比較來確定β-淀粉酶的活性。


二、淀粉酶活性的測定材料,儀器和試劑

序號產品CAS號備注
1麥芽糖6363-53-7
23,5-二硝基水楊酸 609-99-4
3氫氧化鈉1310-73-2
4酒石酸鉀鈉6381-59-5
5檸檬酸77-92-9
6檸檬酸鈉68-04-2
7石英砂14808-60-7
8淀粉酶 9000-92-4

1)材料:發芽的小麥種子(芽長約1cm)。
2)儀器:1.分光光度計; 2.離心機; 3.恒溫水浴(37°C,70°C,100°C); 4.試管帶有塞子刻度; 5.刻度移液器; 6.容量瓶。
3)試劑(所有分析純):
1.標準麥芽糖溶液(1mg / ml):準確稱取100mg麥芽糖,溶于蒸餾水,稀釋至100ml;
2. 3,5-二硝基水楊酸試劑:準確稱取1g 3,5-二硝基水楊酸,溶于20ml 2mol / L NaOH溶液中,加50ml蒸餾水,再加30g酒石酸鉀鈉,待溶解后補足用蒸餾水稀釋至100毫升。緊密關閉塞子,以防止二氧化碳進入。如果溶液渾濁,則可以在過濾后使用。
3.01mol / L檸檬酸緩沖液pH 5.6:溶液(0.1mol / L檸檬酸):稱量21.01g C6H8O7.H2O,用蒸餾水溶解至1L; B溶液(0.1 mol / L檸檬酸鈉):稱取29.41 g Na3C6H5O7.2H2O,用蒸餾水溶解,將體積調至1L。將55ml溶液A與145ml溶液B混合,該溶液為0.1mol / L檸檬酸緩沖液pH 5.6;
4.1%淀粉溶液:稱取1g淀粉,溶于100ml 0.1mol / L pH 5.6檸檬酸緩沖液中。


三、淀粉酶活性的測定實驗程序1)麥芽糖標準曲線的制備:取7個帶有塞尺的干凈試管,編號,并按表添加試劑(詳細的教學材料)。搖勻,在沸水浴中煮沸5分鐘。取出后,將自來水冷卻,并用蒸餾水補足至20 ml。將1號管作為空白零點,并在540nm波長處進行比色法測量。以麥芽糖含量為水平坐標,以吸光度值為垂直坐標繪制標準曲線。
2)酶溶液的制備:稱取1g發芽3天的小麥種子(芽長約1cm),放入研缽中,加入少量石英砂和2ml蒸餾水,研成勻漿。將勻漿倒入離心管中,并用6ml蒸餾水將殘余物洗至離心管中。將提取物置于室溫下提取15-20分鐘,每隔幾分鐘攪拌一次以使其完全提取。然后以3000 rpm的速度離心10分鐘,將上清液倒入100 ml容量瓶中,加入蒸餾水使體積達到刻度,然后搖動成為淀粉酶的儲備液。吸取10毫升上述淀粉酶原液,將其放入50毫升容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,并搖勻以得到淀粉酶稀釋液。
3)酶活性的測定:取6個帶有塞子秤的干凈試管,編號,并按照表(詳細的教學材料)進行操作。


四、淀粉酶活性的測定實驗結論:※ 結果的計算:淀粉酶活性= C×VT /(W×Vs×T)(mg / g / min)。式中,C為從標準曲線求出的麥芽糖含量(mg)。 VT是淀粉酶儲備溶液的總體積(毫升); Vs是反應中使用的淀粉酶儲備溶液的體積(ml); W是樣品重量(g); t它是反應時間(分鐘)。


作者:未知 來源:未知
ELISA實驗
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