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IPTG誘導(dǎo)原理（原核表達(dá)）

在原核蛋白表達(dá)體系中，如E.coli（大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)），外源基因通常需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)才能進(jìn)行表達(dá)，本文詳細(xì)講述了常用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)原理，對(duì)外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)原理以及實(shí)驗(yàn)步驟。

原核生物絕大多數(shù)的基因按功能相關(guān)性成簇地排列，且密集于染色體上，共同形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位——操縱子，也稱基因表達(dá)的協(xié)同單位。E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基轉(zhuǎn)移酶（transacetylase)；此外還有調(diào)控基因：操縱序列O（operator）、啟動(dòng)序列P（promoter）；而I(編碼Lac阻遏物，Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因

IPTG誘導(dǎo)原理.

Lac阻遏物是一種具有4個(gè)相同亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個(gè)與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點(diǎn)。在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物（即下圖中的阻遏蛋白）能與操縱基因O結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄的路徑，從而抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑（這里指IPTG）存在時(shí)，誘導(dǎo)劑可與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來(lái)，RNA聚合酶不再受阻礙，啟動(dòng)子P開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)反應(yīng)開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘恰瓷砩系恼T導(dǎo)劑。而在實(shí)驗(yàn)中，通常選用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑，IPTG是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

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IPTG誘導(dǎo)表達(dá)原理圖

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)方法

原核表達(dá)鑒定詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

1. 表達(dá)鑒定第一天的任務(wù)，常用抗性選擇根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞選擇

拿到質(zhì)粒，離心（3000r/min；2min)
在質(zhì)粒中加入TE【使質(zhì)粒最終加入到110μL感受態(tài)細(xì)胞中的量為80-100ng，據(jù)此確定加入TE的量】，一般為(1μg質(zhì)粒加20μLTE；2μg質(zhì)粒加50μLTE；5μg質(zhì)粒加100μL TE)
將質(zhì)粒與TE混勻，吸取2μL混液與感受態(tài)細(xì)胞混勻
將感受態(tài)細(xì)胞放入冰箱（4℃）中，30min
取出后立即放入水浴鍋中（42℃），熱激90s,
再次放入冰箱（4℃）中，3min
拿出后取200μL的LB液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中
放入搖床（37℃; 195r) 中, 30nim至60min; (最佳45min)
取出離心（3000r/min；2min)
去掉200μL的上清，留100μL左右上清懸浮沉淀，吸取50μL懸液涂平板，【先將對(duì)應(yīng)抗性的平板放入培養(yǎng)箱（37℃）中預(yù)熱20min】
把平板放入培養(yǎng)箱（37℃），過(guò)夜（12h至16h）

2.表達(dá)鑒定第二天的任務(wù)，注意Pcold表達(dá)載體的表達(dá)溫度

每個(gè)平板挑取單菌落至4支對(duì)應(yīng)抗性的LB(4ml)試管中，編號(hào)為“0”“1”“2”“3”
將試管放入搖床（37℃；195r) 中，【單抗3h左右；雙抗4h左右；剛開(kāi)始用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD值；熟練后可目測(cè)（背光下，以試管中的槍頭為例，剛剛看不見(jiàn)槍頭即可）】，測(cè)OD值（0.6至0.8）
從“0”號(hào)管中取700μL懸液加入到100μL（C=80%）的保種甘油中，震勻，放入冰箱（-20℃）凍存
在每組菌的“1”“2”“3”號(hào)試管中分別加入2μL的IPTG【終濃度0.5mM最適，可根據(jù)日后表達(dá)摸索】
視不同的載體選擇適合的表達(dá)環(huán)境【PET/PGEX：15℃表達(dá)過(guò)夜；25℃表達(dá)6h；37℃表達(dá)3h至4h（4支試管，“0”“1”號(hào)試管15℃表達(dá)過(guò)夜；“2”“3”試管37℃表達(dá)3h至4h）。Pcold：【全部15℃表達(dá)過(guò)夜】

3.表達(dá)鑒定第三天，全菌的表達(dá)鑒定分析，注意控制溶質(zhì)的量及溶液黏度

從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中，【若OD值不一樣，值小的可多取】離心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液離心，盡量使沉淀量接近】
在每個(gè)離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀，離心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀
在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer懸浮沉淀【當(dāng)溶質(zhì)適量且均一的情況下，加入量不變；當(dāng)溶質(zhì)多且粘稠時(shí)，應(yīng)使加入量增大，為降低粘度也可減少上液量】
放入煮樣器（100℃） 25min
取出后離心（6000r/min) 3min, 電泳檢測(cè)。
蛋白表達(dá)量不錯(cuò)，進(jìn)行蛋白純化.蛋白表達(dá)量低或者沒(méi)表達(dá)就菌株與質(zhì)粒、誘導(dǎo)條件、目的蛋白特性、培養(yǎng)環(huán)境及檢測(cè)環(huán)節(jié)五大類來(lái)進(jìn)行排查分析。

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