2022年3月以來，狡猾的奧密克戎變異毒株又一次打破了人們平靜的生活，全國各地陸續(xù)爆發(fā)新冠疫情，波及30個(gè)省（區(qū)、市）。  核酸檢測(cè)作為新冠疫情精準(zhǔn)防控的有效手段，儼然已成為一種生活常態(tài)，“今天你核酸了嗎？  ”也轉(zhuǎn)變?yōu)槿藗兊娜粘柡蛘Z。  說到這，大家了解核酸檢測(cè)中需要用到哪些核心原料嗎？  本文就來介紹一下核酸檢測(cè)中最關(guān)鍵的核心原料-酶。  

新冠核酸檢測(cè)流程

酶是一類極為重要的生物催化劑，具有催化高效性和反應(yīng)特異性。絕大多數(shù)生化反應(yīng)均需要酶的參與，核酸檢測(cè)也不例外。在新冠核酸檢測(cè)過程中（圖1所示），不同類型的分子酶在核酸檢測(cè)的不同實(shí)驗(yàn)階段（核酸提取、RT-qPCR）發(fā)揮了重要的作用。 接下來，根據(jù)核酸檢測(cè)中的不同實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)為大家梳理核酸檢測(cè)過程中用到的核心酶原料。  

圖1.新冠核酸檢測(cè)流程

核酸提取過程中的核心酶

新冠病毒核酸提取過程主要包括裂解和純化兩大步驟： 

 裂解  是破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程；  

純化  則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離，反應(yīng)過程需要蛋白酶K（Proteinase K）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）及RNase抑制劑的參與。

蛋白酶K

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵（圖2所示）。在核酸提取過程中，蛋白酶K可降解與核酸緊密結(jié)合的組蛋白，促進(jìn)核酸的分離，使樣本核酸能更好的被提取。另外，蛋白酶K可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板RNA。

圖2.蛋白酶K水解肽鍵示意圖

韻邦制藥蛋白酶K來源于基因重組酵母菌株，比活性≥30 U/mg蛋白，不含RNase和DNase，在尿素和SDS溶液中酶活性穩(wěn)定存在，在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4.0~12.0）均有活性，適用于原位雜交樣本制備，核酸純化等實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的切割清除。  

脫氧核糖核酸酶Ⅰ

脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I）可催化多種形式DNA，靶向切割鄰近嘧啶的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5’端為磷酸基團(tuán)、3’端為羥基的多聚核苷酸，平均消化產(chǎn)物最小為多聚四核苷酸。在新冠核酸提取過程中，DNase I主要用于除去RNA樣本中的基因組污染，避免RNA模板中存在DNA殘留，提高模板純度。 韻邦DNase I來源于重組E. coli菌株，不含RNase，可以用于各種RNA樣品的處理，最佳的工作pH范圍是7-8。在Mg  2+  存在下，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；而在Mn  2+  存在的條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端或有1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端（圖3所示）。

圖3.DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖

RNase抑制劑

在新冠核酸檢測(cè)過程中，樣本核酸的提取、純化或?qū)嶒?yàn)的反應(yīng)體系配制的過程中，均有可能引入核糖核酸酶（RNase）的污染，導(dǎo)致RNA模板被降解。若要避免RNase的污染，則需要RNase 抑制劑（RNase Inhibitor）發(fā)揮作用。 RNase Inhibitor是人的胎盤中存在的一種特異性RNase抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。韻邦鼠源RNase抑制劑Murine RNase Inhibitor（Cat#10603ES）不含人源蛋白中的兩個(gè)對(duì)氧化非常敏感的半胱氨酸，具有更高的抗氧化活性，能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C)，更加適合于對(duì)高二硫蘇糖醇（DTT）敏感性的實(shí)驗(yàn)如qPCR反應(yīng)。

RT-qPCR過程中的核心酶

在完成新冠樣本核酸提取后，可通過RT-qPCR來完成核酸的檢測(cè)。在這些實(shí)驗(yàn)過程中，DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶都是必不可少的核心酶原料。

逆轉(zhuǎn)錄酶

提取純化后新冠病毒RNA，在進(jìn)行qPCR反應(yīng)前需先通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化dNTP聚合（即RT-Reverse Transcription，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），生成與模板RNA互補(bǔ)的cDNA序列（圖4）。對(duì)于RT-qPCR反應(yīng)，應(yīng)選擇可耐高溫的逆轉(zhuǎn)錄酶，目前市面上應(yīng)用最廣泛的為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，因其缺乏DNA內(nèi)切酶活性且RNase H活性較低，在cDNA克隆應(yīng)用中更有優(yōu)勢(shì)。  

圖4.逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖   

韻邦制藥第五代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶（Cat#11300ES）是通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶，熱穩(wěn)定性好，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄，可擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)10 kb的cDNA。

DNA聚合酶

完成模板逆轉(zhuǎn)錄過程生成雙鏈cDNA以后，就需要PCR反應(yīng)中的“靈魂選手”DNA聚合酶閃亮登場(chǎng)，通過聚合游離的脫氧核糖核苷酸進(jìn)行DNA鏈的延伸，在體外完成模板DNA的大量擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)病毒核酸可被檢測(cè)的目的。 在RT-qPCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶為熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，該類酶在常溫條件下無活性，只有經(jīng)過熱啟動(dòng)以后才具有聚合活性，可以最大限度地減少背景信號(hào)的生成，很好的解決了常規(guī)PCR反應(yīng)中引物二聚體產(chǎn)生或錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增等問題。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動(dòng)修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動(dòng)修飾方法原理如圖5所示。  

圖5.不同類型修飾熱啟動(dòng)酶原理圖

韻邦制藥High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL（Cat#10726ES）是雙抗體進(jìn)行雙封閉的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，具有高模板親和力。在常溫下不僅封閉了5'→3'聚合酶活性，同時(shí)也封閉了5'→3'核酸外切酶活性。在95℃條件下變性30sec其封閉抗體即可完全失活，釋放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性。雙封閉特性不僅能有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，又能有效抑制探針降解產(chǎn)生的熒光信號(hào)下降，雙重保障使體外檢測(cè)試劑在運(yùn)輸或室溫使用過程中更加穩(wěn)定。

尿嘧啶DNA糖基化酶

在新冠核酸檢測(cè)過程中，操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽性最常見的因素，在擴(kuò)增體系中加入U(xiǎn)DG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）則可有效消除PCR體系中混入的擴(kuò)增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在），保證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。UDG酶防污染原理如圖6所示。

圖6.UDG酶防污染原理示意圖